Hvorfor mislykkes din WB -eksperimentelle konsekvent? Tjek følgende grunde!

Lad os i dag tale om det problem, der har forårsaget utallige forskningskolleger hovedpine - Western Blot (WB) eksperiment. Dette tilsyneladende enkle, men fulde af "fælder" -eksperiment, hvorfor får det os altid til at snuble igen og igen? Lad os nu gennemgå årsagerne til fiaskoer sammen.

I. Ingen bånd

Mulige grunde kan omfatte:

1. Antistofspørgsmål: Antistoffet kan være ineffektivt, ikke -specifikt eller ikke bindende til målproteinet.
2. Prøveproblemer: Prøven kan indeholde forstyrrende stoffer, være for lav i koncentration eller allerede er nedbrudt.
3. Spørgsmål om elektroforese: upassende elektroforesebetingelser, såsom spænding, tid eller forkert brug af buffer.
4. Overførselsproblemer: Problemer under overførselsprocessen, såsom upassende valg af membran, overførselstid eller overførselsbuffer.
5. Blokering af problemer: Den blokerende løsning kan være upassende, eller blokeringstiden kan være for lang.
6. Farvningsproblemer: farvningsreagenset kan udløb, ufølsomme eller forkert anvendt.

Udstyrsproblemer: Udstyret kan fungere eller ikke være korrekt kalibreret.

1. Eksperimentelle driftsproblemer: Den eksperimentelle operation er muligvis ikke standardiseret, såsom utilstrækkelig vask eller ujævn prøvebelastning.
2. Problemer med proteinmodifikation: Målproteinet kan gennemgå post-translationelle modifikationer, der forhindrer antistofgenkendelse.
3. Målproteinekspressionsproblemer: Målproteinet kan have meget lavt ekspression eller ingen ekspression i cellerne eller vævene, der detekteres.

Ii. Høj baggrund

Mulige grunde kan omfatte:

1. Høj antistofkoncentration: Brug af for meget antistof kan øge ikke -specifik binding, hvilket resulterer i høj baggrund.
2. Problemer med antistofkvalitet: Antistoffet kan have høj ikke-specifik binding eller krydsreagere med andre proteiner.
3. Utilstrækkelig blokering: Den blokerende løsning dækker ikke effektivt ikke -specifikke bindingssteder på membranen, hvilket resulterer i høj baggrund.
4. Membranproblemer: Membranen kan have dårlig kvalitet eller forurening, hvilket fører til høj baggrund.
5. Ufuldstændig overførsel: Under overførselsprocessen overføres proteiner muligvis ikke fuldt ud til membranen, hvilket resulterer i høj baggrund.
6. Utilstrækkelig vask: Vasketrinnene fjerner ikke effektivt ubundet antistof eller andre urenheder, hvilket fører til høj baggrund.
7. Farvningsreagensproblemer: Farvningsreagenset kan være for følsomt eller ustabilt, hvilket resulterer i høj baggrund.
8. Problemer med eksperimentelle udstyr: Udstyret kan have lækage eller interferens, hvilket fører til høj baggrund.
9. Problemer med proteinprøve: Prøven kan indeholde en stor mængde forstyrrende stoffer, såsom proteinnedbrydningsprodukter eller andre urenheder.
10. Eksperimentelle driftsproblemer: Den eksperimentelle operation er muligvis ikke standardiseret, såsom langvarig inkubationstid eller høj temperatur.

III. Ikke -specifikke bånd eller forkerte proteinbåndstørrelser

Mulige grunde kan omfatte:

1. For mange passager af celler, hvilket resulterer i forskellige proteinekspressionsniveauer, hvilket fører til inkonsekvente båndstørrelser eller tilstedeværelsen af ​​flere bånd.
2. Proteinprøve -nedbrydning, hvilket resulterer i lavere proteinmolekylvægt eller tilstedeværelsen af ​​flere bånd.
3. In vivo udtrykte proteinprøver kan have forskellige former for modifikationer, såsom acetylering, methylering, alkylering, phosphorylering og glycosylering, hvilket fører til inkonsekvente båndstørrelser eller tilstedeværelsen af ​​flere bånd.
4. Målproteinet indeholder flere isoformer eller splejsningsvarianter, hvilket resulterer i inkonsekvente båndstørrelser eller tilstedeværelsen af ​​flere bånd.